УТРАТИЛО СИЛУ               в соответствии с приказом Минздрава КР                     от 24 февраля 2010 года № 103 Зарегистрировано в Министерстве юстиции Кыргызской Республики 3 июля2002 года. Регистрационный номер 101-02                                Утверждено                         приказом Министерства                            здравоохранения                         Кыргызской Республики                      от 10 июня 2002 года № 240                                РУКОВОДСТВО                по лабораторной диагностике бруцеллеза    Для   лабораторной   диагностики  бруцеллезной  инфекции   у   людейприменяются следующие методы: бактериологический и серологический.  Вся   работа  по  выделению  и  дифференциации  бруцелл  из   любогоисследуемого  материала должна проводиться в условиях, предупреждающихвозможность   инфицирования  персонала  и   обсеменение   возбудителемобъектов  внешней  среды,  в  строгом соответствии  с  "Инструкцией  опротивоэпидемическом  режиме  работы  с  материалом,  зараженным   илиподозрительным на зараженность возбудителями инфекционных  заболеванийI-II групп", утвержденной МЗ КР 9.11.1994 г.  Серологические  реакции  являются  общедоступными  методами,  как  вусловиях  стационара, так и при массовых обследованиях  на  бруцеллез.Рекомендуется  применять  следующие  серологические  методы:   реакцииагглютинации  - пластинчатую (Хеддельсона), объемную (Райта),  реакциюпассивной гемагглютинации (РПГА).                        1. Бактериологический метод    Характерной  особенностью рода Brucella является медленный  рост  напитательных  средах, особенно в первых генерациях. При  посеве  крови,костного мозга и мочи культуры бруцелл обнаруживаются через 5-10 дней,а  иногда  через  20-30 дней после засева. При этом  первые  генерациикультур  Br.  Abortus и Br. Ovis способны расти только при  наличии  ватмосфере  повышенного  содержания углекислоты  (5-10%).  Биотипы  Br.Abortus 5, 6 и 7 могут расти в обычных аэробных условиях.  Для   выделения  культуры  бруцелл  рекомендуются  следующие  среды:эритрит  -  агар,  Albimi - агар, среда "Д", печеночные  мясопептонныеагары и бульон (рН сред - 6.8; 7.2).  Посевы следует производить на предварительно проверенные питательныесреды.  Для  проверки агара из 2-х суточной культуры. Br. Melitensis или Br.Abortus  готовят суспензию бруцелл в концентрации 200 мк. В 1  мл  (постандарту мутности ГИСК им.Тарасовича). Посев проводят на 4 чашки  пол0,1  мл (20 мк) суспензии. Агар признается годным, если через 5  сутокпребывания в термостате при 37 град. в среднем вырастает не  менее  18колоний на чашке.    Исследование крови    Посевы  крови рекомендуется делать во время лихорадочного  состояниябольного,  так  как  в  этот  период  наблюдается  наибольший  процентвыделения культур.  Однако  не  исключена  возможность  получения  гемокультуры  и   принормальной  температуре.  Кровь для посева следует  брать  до  леченияантибиотиками.  Посевы  крови  рекомендуется  проводить   во   флаконы(желательно  в прямоугольные) емкостью 100-200 мл, в которые  наливаютпо  30-50  мл агара. После стерилизации их укладывают так, чтобы  агарзастыл  на  одной из стороны флакона. Затем в каждый флакон  стерильнодобавляют  по  25-30 мл предварительно простерилизованного  бульона  ивыдерживают в термостате при 37 градусах в течение 2-3 суток.  Агар  сбульоном  может  быть  использован  не  позднее  5-7  дней.  Кровь   вколичестве не менее 10 мл стерильно берут шприцем из локтевой  вены  изасевают  по  5  мл  в  два флакона. Один из флаконов  инкубируют  приповышенном  содержании  углекислоты  (5-10%),  а  другой   в   обычныхусловиях. Начиная с четвертого дня после посева, флаконы просматриваюти  при  отсутствии роста культуры, поверхность агара орошают бульоном.При  положительном результате на поверхности агара появляются  колониибруцелл. Если в течение месяца бруцеллы не обнаруживаются, то  в  этомслучае  делают  контрольный высев из бульона  на  твердую  питательнуюсреду.  Больных  хронической  формой бруцеллеза  в  период  обострения(особенно  при  субфебрилитете) перед началом  лечения,  рекомендуетсяпроводить посевы крови, пунктатов костного мозга и лимфатических узловна специально питательную среду для выделения L - культур бруцелл.  Способ  посева бактериологического материала для выделения L культуридентичен с методом выделения бактериальных гемокультур.  Посевы выдерживаются в термостате не менее 35-40 дней.                          2. Серологический метод    При  проведении  эпидобследования населения в очагах  рекомендуется:реакция  агглютинация - пластинчатая (Хеддельсона) и объемная (Райта),реакция пассивной гемагглютинации.  При  проведении обследования нужно учитывать, что если высокие титрыантител  почти  всегда указывают на наличие инфекции,  то  антитела  внизких  титрах  или  их  полное отсутствие  не  исключает  возможностизаболевания.   В  связи  с  этим  рекомендуется  проводить   повторныеисследования с интервалом одна две недели, особенно при подозрении  наострую форму бруцеллеза.  Следует  иметь  в  виду,  что положительную реакцию  агглютинации  сбруцеллезным  антигеном  могут  давать  также  сыворотки,   содержащиеантитела   к  холерному  и  туляремийному  антигенам  (например,   припрофилактической иммунизации против этих инфекций).    Пластинчатая реакция агглютинации (реакция Хеддельсона)    Преимущество этого метода заключается в простоте постановки реакции,быстрое  получение результата и чувствительности реакции.  В  качествеантигена  для постановки реакции Хеддельсона и Райта применяют  единыйбруцеллезный   диагностикум.  Реакцию  ставят  на   обычном   оконном,тщательно  вымытом,  обезжиренном стекле,  расчерченном  на  квадраты,величиной  примерно  4х4  см  каждый, по  горизонтали  должно  быть  5квадратов.  На  первом  квадрате с левой  стороны  записывается  номериспытуемой  сыворотки, в последующие квадраты слева направо  разливают(микропипеткой или 1 мл градуированной пипеткой) испытуемую  сывороткув  следующих  дозах: 0,04; 0,02; 0,01 и 0,03 - контроль  сыворотки.  Кпервым трем дозам сыворотки добавляют по 0,03 мл антигена. К последнейдозе  сыворотки  (0,03)  добавляют 0,03 мл физиологического  раствора.Сыворотку осторожно смешивают с антигеном стеклянной палочкой, начинаяс  минимальной дозы сыворотки. Контроль антигена ставят, добавляя 0,03мл  физиологического раствора к 0,03 мл антигена. Затем стекло  слегкаподогревают  над пламенем спиртовки так, чтобы происходило равномерноенагревание всей поверхности стекла.  В  случае положительной реакции в первые минуты в каплях сыворотки сантигеном появляются хлопья (агглютинат). Максимальный срок наблюдения8 минут.  a)  контроль  сыворотки  ставят с каждой испытуемой  сывороткой  дляисключения спонтанной агглютинации;  b)  контроль  антигена  ставят  один  (при  любом  числе  испытуемыхсывороток)   для   исключения  спонтанной  агглютинации   применяемогоантигена.  Учет реакции проводят невооруженным глазом по следующей схеме:  a)  полное  просветление жидкости крупными или мелкими хлопьями,  тоесть 100% агглютинация (4+);  b)  почти  полное  просветление жидкости с ясно заметными  хлопьями,т.е. 75% агглютинации (3+);  c)  незначительное просветление жидкости с заметными хлопьями,  т.е.50% агглютинации (2+);  d) мутная жидкость с едва заметной зернистостью (+);  e) равномерно мутная жидкость (-).  Для оценки результатов рекомендуется следующая схема:  a)  агглютинация  на 4+ во всех дозах сыворотки -  результат  "резкоположительный";  b)  агглютинации на 2+, 3+ во второй или третий дозах (0,02-0,01  млсыворотки) - результат "положительный;  c)  агглютинации в первой дозе - (0,04 мл сыворотки  )  -  результат"сомнительный";  d)  отсутствие  агглютинации  во  всех  дозах  сыворотки  -  реакция"отрицательная".  Для  диагностики  бруцеллеза  имеет  значение  только  положительныйрезультат  реакции.  При  сомнительном  или  отрицательном  результатереакции  и наличии эпидемических и эпизоотических показаний,  а  такжестационаре  и  при  обследовании доноров, где  необходимо  определениетитра  агглютининов и их динамики, следует применять реакции  Райта  иРПГА.    Реакция агглютинации (Райта)    Реакция  агглютинации является одним из основных методов диагностикибруцеллеза  у  людей.  Наибольшую  диагностическую  ценность   реакцииагглютинации представляет при острой и подострой форме бруцеллеза.  Схема постановки реакции следующая:  В  пробирки разливают физиологический раствор: в первую - 2, 4 мл  иостальные по 0,5 мл.  В   первую   пробирку   добавляют  0,1  мл   испытуемой   сыворотки,перемешивают, переносят 0,5 мл смеси во вторую пробирку, перемешивают,переносят 0,5 мл в третью пробирку и т.д. Из последней пробирки 0,5 млсмеси  выливают,  в результате получают в каждой пробирке  по  0,5  млследующих  разведений:  1:25; 1:50; 1:100;  1:200  и  т.д.  Из  первойпробирки  0,5  переносят в чистую пробирку и  добавляют  туда  0,5  млфизиологического  раствора (контроль сыворотки) в разведении  1:50,  а1,0 мл выливают.  Диагностикум    разводят    физиологическим    раствором    согласноприлагаемому к нему наставлению и добавляют по 0,5 мл во все пробирки,кроме  контроля.  После добавления диагностикума разведение  сывороткисоответственно удваивается, т.е. получается 1:50; 1:100; 1:200 и  т.д.Сыворотки  с  антигеном  смешивают путем  встряхивания  и  помещают  втермостат  (37  град.)  на  18-20  часов.  После  инкубации   пробиркивыдерживают  один-два часа при комнатной температуре и  проводят  учетреакции.  Учет реакции проводят по стандарту мутности в зависимости от степениосаждения агглютината и просветления жидкости.  Для   приготовления  стандарта  мутности  антиген,  применяемый  дляпостановки РА, еще раз разводят в два раза.  Дальнейшее   разведение   антигена  физиологическим   раствором   последующей схеме:-----------------------------------------------------------------------|                             |          Степень агглютинации         ||                             |---------------------------------------||                             |  ++++ |  +++  |   ++  |   +   |   -   ||-----------------------------|-------|-------|-------|-------|-------||Антиген разведения 1:2       |   0   |  0,25 |  0,5  |  0,75 |  1,0  ||Физ. раствор                 |   1,0 |  0,75 |  0,5  |  0,25 |  0    ||Процент просветления         | 100   | 75    | 50    | 25    |  0    |-----------------------------------------------------------------------  Стандарт  мутности готовят каждый раз при поставке  РА  и  ставят  втермостат одновременно с основной реакцией.  Титром  сыворотки  является максимальное ее разведение,  дающее  50%агглютинации - просветление, оцениваемое на 2+.  При  применении стандартизированного диагностикума титры исследуемыхсывороток   соответствуют  количеству  международных  единиц   антител(ме./мл). Так, титр 1:50; 1:100; 1:200 и т.д. Соответственно равны 50,100, 200 и т.д. ме./мл.  При   диагностической   оценке  результатов   реакции   агглютинациирекомендуется следующая схема:  - титр сыворотки 1:50 (50 ме./мл) - результат сомнительный;  - титр сыворотки 1:100 (100 ме./мл) - результат положительный;  -   титр   сыворотки   1:200  (200  ме./мл.)   -   результат   резкоположительный.    Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)    РПГА  является специфичным и высокочувствительным методом  выявлениябруцеллезных  антител в сыворотке крови человека. Для постановки  РПГАнеобходимо иметь:  a) бруцеллезный эритроцитарный антигенный диагностикум;  b) контрольные (несенсибилизированные) эритроциты;  c) нормальную сыворотку кролика;  d)  бруцеллезную сыворотку. (Эритроцитарный антигенный  бруцеллезныйдиагностикум выпускает Одесский завод бак. препаратов УР.  В  комплектвходят все остальные ингредиенты для постановки РПГА).  Для титрования испытуемых сывороток применяется нормальная сывороткакролика,  инактивированная при 56 град. Цельсия в течение 30  минут  иразведенная физиологическим раствором 1:100.  Испытуемую сыворотку разводят физиологическим раствором 1:25 (0,1 млсыворотки + 2,4 мл физиологического раствора) и инактивируют в течение30   минут   при  56  град.  Цельсия.  Перед  исследованием  сывороткуадсорбируют   50%   взвесью   контрольных   эритроцитов.   К   12   млинактивированной   сыворотки  добавляют  0,2   мл   50%   эритроцитов,встряхивают  и оставляют на 30 минут при комнатной температуре.  Затемсмесь  центрифугируют  при 1000 об./мин. в течение  2-х  минут.  Можнооставить  сыворотки  с эритроцитами на ночь в холодильнике  (+4  град.Цельсия), в том случае исключается центрифугирование.  Эритроцитарный     диагностикум    перед    применением     разводятфизиологическим раствором (рН 7,0-7,2) согласно указанию на этикетке иполучают  2,5%-ную  взвесь, которая применяется  в  РПГА.  Контрольные(несенсибилизированные) эритроциты также разводят согласно указанию наэтикетке и применяют полученную 2,5%-ную взвесь для контроля сывороток(1,9 физ. Раствора + 0,1 эритроц. 50%).    Схема постановки РПГА    Реакцию  ставят  в прозрачных полистироловых пластинках  с  лунками.Каждую  сыворотку исследуют не менее чем в 6-8 разведениях, начиная  с1:50.  Сначала нормальную разведенную 1:100 инактивированную сывороткукролика  разливают  во  все  лунки по 0,5 мл,  затем  в  первую  лунку(контроль  сыворотки  вносят 0,5 испытуемой сыворотки,  предварительноинактивированной и разведенной 1:25, перемешивают и 0,5  выливают.  Вовторую  лунку  также  добавляют  0,5 мл испытуемой  сыворотки  (1:25),перемешивают,  переносят 0,5 в третью лунку  и  титруют  сыворотку  доконца  ряда, из последней лунки 0,5 выливают. Таким образом,  получаютряд   последовательных  двукратных  разведений  испытуемой  сыворотки,начиная с 1:50 в объеме 0,5 мл.  В  первые лунки (контроль сыворотки) добавляют микропипеткой по 0,05мл контрольных эритроцитов. Затем в каждую лунку, начиная со второй, спомощью  микропипетки  добавляют по 0,05  мл  диагностикума.  Пластиныосторожно  встряхивают  до  полного перемешивания  содержимого  лунок,следя,  чтобы  не  было  разбрызгивания  жидкости,  и  оставляют   прикомнатной температуре. Учет реакции проводят через 2 часа.  При постановке РПГА предусматриваются следующие контроли:  a) контроль качества нормальной сыворотки кролика (1:100) проводят вдвух  лунках. К 0,5 мл сыворотки добавляют в первую лунку 0,05 мл  25%взвеси диагностикума, во вторую - 0,05 мл контрольных эритроцитов;  b)  качество  диагностикума проверяют путем титрования специфическойбруцеллезной сыворотки, начиная с разведения 1:50 до 1:100000. Затем вкаждую лунку добавляют по 0,05 мл 2,5% взвеси диагностикума (1,9  физ.раствора + 0,1 эритроц. 50%).  Реакция  считается  специфической, если в  контролях  исследуемых  вконтрольной    сыворотке   отсутствует   гемагглютинация,    а    титрспецифической   сыворотки  в  реакции  будет  соответствовать   титру,указанному на этикетке флаконов эритроцитарного диагностикума.  Оценка реакции проводится по следующей схеме:  4 (+) - эритроциты покрывают все дно лунки равномерным слоем, иногданаблюдается зонтик;  3 (+) - эритроциты выстилают все дно лунки тонким равномерным слоем,но  площадь его меньше, чем при 4-х крестовой реакции, размеры зонтикатакже меньше;  2 (+) - агглютинат не большой, расположен в центре лунки;  1   (+)  -  вокруг  осадка  эритроцитов  в  центре  виден  небольшойагглютинат.  Отрицательная  реакция - осадок эритроцитов  на  дне  лунки  в  видепуговки или маленького кольца.  За  титр  сыворотки  принимают  ее последнее  разведение  с  оценкойреакции не менее чем 3+. Оценка результатов исследования сывороток  набруцеллез в РПГА у людей: титр 1:50 - реакция сомнительная, титр 1:100и  выше  - реакция положительная. При записи результатов РПГА  следуетуказывать титр сыворотки.